穆军升医生的科普号

据WHO报道我国冠心病（CAD）发病率，病死率每年呈上升趋势。我国历年因冠心病死亡人数高达100多万，平均每3个人就有1个死于冠心病[1],重症冠状动脉疾病包括心肌梗死和缺血性心肌病，缺血性心肌病患者最重要的治疗手段是冠状动脉血运重建，如冠状动脉介入治疗、冠状动脉搭桥手术等。对于重症缺血性心肌病患者是否应该行再血管化治疗目前尚存在争议[２]，但大部分患者治疗后可改善心肌功能、缓解心衰症状、提高生活质量，其前提是具有足够量的可挽救的心肌[３]。而对于心肌细胞已经死亡的缺血心肌，除治疗过程的损伤外，对心肌功能改善毫无意义。因此，无创性检测心肌是否存活是预测患者再血管化治疗疗效的关键[４]。完全不可逆性心肌梗死（如透壁心梗）治疗风险高、疗效差，而慢性心肌缺血无梗死（如冬眠心肌、顿抑心肌）治疗后心肌功能明显改善，疗效显著。因此，对于左心功能障碍及重症冠心病患者术前确定缺血与梗死心肌的范围和程度对于手术的实施与否就显得特别重要，国内外至今没有文献报告18F-FDG PET心肌代谢显像联合超声心动图对重症冠状动脉疾病患者冠状动脉搭桥术实施的适应症。本文将通过回顾性的分析总结18F-FDG PET心肌代谢显像联合超声心动图，在重症冠状动脉病变的冠心病患者实施冠状动脉搭桥术治疗方案中的应用价值。1.对象和方法1.1研究对象38例入住北京安贞医院心外科的重症冠心病患者，纳入标准：①冠状动脉造影(CAG)示：至少1支冠状动脉直径狭窄100％；②首次行血运重建术的患者。③左室射血分数≦50％。排除标准：①CAG≦99％狭窄的患者②肝肾功能不全者③心房颤动等心律失常；④并发脑病；⑤严重肺源性心脏病。研究对象38例，其中男32例，女6例，年龄（59±9.7）岁(33～73)，均根据病史、血清酶学及ECG等检查确诊。38例患者都做了冠状动脉造影,其中单支病变2例,双支病变23例,三支病变13例,4例合并有室壁瘤。NYHA分级为3~4级。完善常规血液化验，胸片及心电图等常规入院检查，双侧颈动脉椎动脉超声，双下肢动脉超声，双下肢深浅静脉超声，乳内动脉超声等血管检查完善后。所有患者行超声心动图，PET检查。根据本院医生临床经验，结合患者基本情况，主要依据心肌代谢显像结果和超声心动图评估，将38例患者中20例患者实施冠状动脉搭桥术（CABG）为（A1组，n=20），未实施CABG为(A2组，n=18),行介入或保守治疗。实施冠状动脉搭桥术中，搭1根桥血管的1例，2根桥血管7例，3根桥血管9例，4根桥血管3例；2例患者实施搭桥+室壁瘤切除术，体外循环下手术手术4例，心脏阻断时间35～130(74±24)min，转机时间45～234(133±30)mim。1.2显像仪器和方法1.2.1 PET心肌代谢显像心肌代谢显像采用德国西门子公司PET/CT仪（Truepoint Biography 64，SiemensHealthcare,Knoxville，TN）。患者在禁食状态下口服25~50 g葡萄糖，根据血糖水平静脉注射胰岛素，调节血糖至所需范围之后[5,6]，静脉注射111~185 MBqF-FDG，1 h后行门控PET心肌代谢显像，以心电图R波触发门电路同步采集10 min，每个心动周期采集8帧图像，能峰为511 keV。矩阵128×128，放大倍数为2.0。图像重建采用迭代法（迭代4次，子集数为8），获得左心室短轴、水平长轴和垂直长轴图像。门控图像采用QGS软件进行分析。显像后，由两位不知道临床资料的核医学科医生共同评价。根据17节段法用半定量4分法进行评判[7]。在17节段的基础上按更有临床应用价值的5节段(前壁、心尖、间壁、下后壁、侧壁)整理相应信息。进一步量化分析后，得到异常心肌所占比例和梗死心肌所占比例。1.2.2超声心动图采用Philips iE33彩色多普勒超声诊断仪，X5-1探头，频,1.7~3.4 MHz。观察室壁运动，左室射血分数(LVEF)采用双平面simpson法测量左心室长轴、短轴观及心尖四腔观。入选患者分别于术前7天内测得LVEF和LVEDD，评价患者术前的心功能。1.3统计学方法：应用SPSS 20.0统计软件分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差(±s)表示，偏态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）表示，计数资料以率表示，组间比较采用重复测量设计的方差分析，P<0．05为差异有统计学意义。采用双变量相关分析法进行关联分析，当︱r︱≥0.8时，可视为高度相关；当0.5≤︱r︱<0.8时，可视为中度相关；当0.3≤︱r︱<0.5时，视为低度相关；当︱r︱<0.3时，说明两个变量之间的相关程度极弱，P<0．05有统计学意义。2结果2.1心肌代谢的比较A1组异常心肌为(28.9±6.3)%，A2组异常心肌(43.3±4.5)%(p<0.001)，手术组异常心肌比例小，未手术组异常比例大，两组具有显著统计学差异，;A1组梗死心肌为(13±4.1)%，A2组（24.2±5.5)%(p<0.001)，手术组梗死心肌比例小，未手术组梗死心肌比例大，两组具有显著统计学差异。2超声心动图的比较A1组LVEF为(45.3±3.8)%，A2组为(36.1±6.3)%(p=0.001)，手术组左室射血分数高于未手术组，两组具有显著统计学差异。A1组LVEDD为（54.2±7.1）mm，A2组（65.1±5.8）mm(p=0.003)，手术组左室舒末内径小于未手术组，两组具有显著统计学差异。异常心肌（%）梗死心肌（%）术前LVEF（%）术前LVEDD（mm）术后LVEF（%）A128.9±6.313±4.145.3±3.854.2±7.151.6±9.3A243.3±4.524.2±5.536.1±6.365.1±5.8未测2.3心肌代谢与超声心动图的相关性双变量相关分析显示，异常心肌所占比例和射血分数为中度负相关，相关系数r为-0.603(P=0.006），梗死心肌所占比例和射血分数为低度负相关，相关系数r为-0.477(P=0.039）。心肌代谢显像和患者心功能有负相关性。2.4重症冠状动脉疾病患者经过心肌代谢显像联合超声心动图的评估后，20例实施CABG患者手术顺利，治愈率100%，术后IABP置入1例，二次开胸止血1例。A1组术后平均ICU监护时间(75．8±28．5)h，术后机械通气时间(16．1±6．9)h。无手术和住院死亡，复查满意后顺利出院。A1组术前术后LVEF分别为(45.3±3.8)%vs（51.6±9.3）%(p=0.043)，术后患者心功能得到了明显改善。A1组出院后随访1-10个月，随访率100%，仅有1例再发心绞痛，无远期死亡及心力衰竭等心脏事件发生。PET检查异常心肌在(28.9±6.3)%，梗死心肌所占比例(13±4.1)%，超声心动图检查LVEF为(45.3±3.8)%，LVEDD为（54.2±7.1）mm的情况下，冠状动脉搭桥术可以安全实施且术后疗效满意。3讨论核素心肌代谢显像能很好地评估心肌存活状态，有助于心肌梗死患者治疗策略的选择，而且能较好地预测和评价治疗后心功能及临床症状的改善情况[8]。1986年，加州大学洛杉矶分校最早发表了关于使用18F-FDG PET显像评估人心肌存活的报道[9]。国外最新研究报道，冬眠心肌伴左室功能障碍者再血管化治疗后疗效显著，生存期明显延长[10]。18F-FDG PET心肌代谢显像作为一种高度完善可靠的方法来检测心肌存活已被美国心脏协会作为分类指南，来预测部分患者左室功能改善及心衰后血管再生情况[11]。美国心脏协会指南推荐Ⅱa级患者优先行心肌存活显像[12-13]。2010年出版的欧洲指南也推荐冠心病患者及严重左室功能障碍者行核素心肌代谢显像[14]。PET心肌显像预测血运重建术后局部心功能改善方面的灵敏度和特异度分别为92%和63%,预测左室总体功能改善的灵敏度和特异度分别为83%和64%[15]。重症冠心病患者，判断心肌的存活与成功的手术同等重要。冠脉搭桥术前要准确预测心肌血流灌注异常区、室壁活动消失区心肌细胞是否存活，患者的心功能，进而决定是否值得实施搭桥手术，特别是3支完全闭塞的患者，如果存活心肌很少，即使手术很成功，也不能给患者带来更多的益处，反而会给患者带来不必要的创伤和经济受担。因此，术前预测心肌灌注代谢异常区心肌的存活性，是决定搭桥术后心功能能否恢复的重要依据。本研究回顾性的分析了北京安贞医院心外科行PET检查的重症冠状动脉病变患者通过PET心肌代谢显像联合超声心动图的评估，为进一步是否实施搭桥手术提供有力的依据,为临床治疗提供重要建议。分析表明，当异常心肌在(28.9±6.3)%，梗死心肌所占比例(13±4.1)%，LVEF为(45.3±3.8)%的情况下，冠状动脉搭桥术可以安全实施且术后疗效满意。过去对于重症冠状动脉疾病患者是否能够实施CABG，仅依靠心脏超声去评估心脏功能的情况，往往评估是不全面，不确切的，结合心脏代谢显像判断心肌的存活，提高了术前诊断的准确性，经过研究，心肌代谢显像和心脏超声有相关性，心肌代谢显像联合心脏超声对冠状动脉搭桥术具有更好的评估价值。由于本次研究的样本量比较小，且是单中心研究，所以有可能存在偏态分布的问题，同时本研究包括了同期合并室壁瘤手术，是因为我们考虑室壁瘤的形成均和存活心肌的状态直接相关，是心肌存活状态所导致的不同结果。若选择单纯CABG的患者进行研究，可以避免上述可能造成的病例选择偏倚。北京安贞医院PET中心为2014年底正式投入运行，所以病例样本数量偏小，其结果和结论还需要大样本的前瞻性研究来证实。参考文献[1]中国医师协会心血管内科医师分会，《中华内科杂志》编辑委员会，心血管疾病一级预防中国专家共识[J].中华内科杂志，2010，49（2），174-185.[2]Cortigiani L,Bigi R,Sicari R,Is viabilityｓstill viable after the STICH trial?[J]．Eur Heart J Cardiovasc Imaging,2012,13(3),219-226[3]Arrighi JA,Dilsizian V.Multimodality imaging for assessment of myocardial viability:nuclear,echocardiography,MR,and CT.[J]Curr Cardiol Rep.2012 Apr;14(2):234-43.[4]Sharir T,Germano G,Kang X,et al.Prediction of myocardial infarction versus cardiac death by gated myocardial perfusion SPECT:risk stratification by the amount of stress-induced ischemia and the poststress ejection fraction.J Nucl Med.2001 Jun;42(6):831-7.[5]Zhang XL,Liu XJ,Wu QY,et al.Clinical outcome of patients with previous myocardial infarction and left ventricular dysfunction assessed with 99Tcm-MIBI myocardial SPECT and 18F-FDG myocardial PET.JNucl Med,2001,42:1166-605.[6]Zhang XL,Liu XJ,Hu SS,et al.Long-term survival of patients with viable and nonviable aneu-rysms assessed by 99Tcm-MIBI SPECT and 18F-FDG PET:A comparative study of medical and surgical treatment.J Nucl Med,2008,49:1288-1298.[7]Slart RH，Bax JJ，de BoerJ，et a1．Comparison of99Tcm-sestamibi／18F-FDG DISA SPECT with PET for the detection of viability in patients with coronary artery disease and left ventricular dysfunction．Eur J Nucl Med Mol Imaging，2005，32：972-979.[8]黄中柯,楼岑,史国华,等．99Tcm-MIBI SPECT和18F-FDG双核素同步显像在心肌梗死诊疗中的价值[Ｊ]．浙江大学学报：医学版,2010,39（5）：530-533.[9]Tillisch J,Brunken R,Marshall R,et al.Reversibility of cardiacwall-motion abnormalities predicted by positron tomography[J].N Engl J Med,1986,314(14):884-888.[10]Ling LF,Marwick TH,Flores DR et al.Identification of Therapeutic benefit from revascularization in patients with left ventricular systolic dysfunction:Inducible ischemia versus hibernating myocardium[J].Circ Cardiovasc Imaging,2013,6(3):363-372.[11]Patel MR,Dehmer GJ,Hirshfeld JW,et al.ACCF/SCAI/STS/AATS/AHA/ASNC2009 Appropriateness criteria for coronary revascularization[J].J Am Coll Cardiol,2009,53(6):530-553.[12]Hunt SA,Abraham WT,Chin MH,et al.2009 Focused update incorporatedinto the ACC/AHA 2005 guidelines for the diagnosis and management of heart failure in adults:A report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines developed in collaboration with the International Society for Heart and Lung Transplantation[J/OL].J Am Coll Cardiol,2009,53(15):e1-90[2014-12-20].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19358937.[13]Hillis LD,Smith PK,Anderson JL,et al.2011 ACCF/AHA guideline for coronary artery bypass graft surgery.A report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines.Developed in collaboration with the American Association for Thoracic Surgery,Society of Cardiovascular Anesthesiologists,and Society of Thoracic Surgeons[J/OL].J Am Coll Cardiol,2011,58(24):e123-210[2014-12-20].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22070836.[14]The task force on myocardial revascularization of the European Societyof Cardiology(ECS)and the European Association for Cardiothoracic Surgery(EACTS).Guidelines on myocardial revascularization[J].Eur Heart J,2010,31(20):2501-2555.[15]黄钢,石洪成.心脏核医学[M].上海:上海科学技术出版社,2011.

干细胞治疗是一种具有治疗多种疾病(心肌梗死，神经退行性疾病，软骨组织修复等)潜力的有效方法，绝大部分正常的体细胞处于分化的末端，一旦凋亡或者意外受损之后不能够再生，干细胞移植可以利用干细胞的分化潜能代替部分受损的细胞组织，但是细胞移植过程中缺乏有效的载体会大大影响其成活和增殖，探索一种生物材料能够为细胞提供合适的生长环境，有效减少细胞流失就显得尤为必要［1-3］。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES细胞）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。目前体外分离和培养胚胎干细胞的实验方法已经趋于成熟，它们可以被大量培养和扩增，通过悬滴法形成拟胚体后，在诱导剂的诱导下，可定向分化为心肌细胞［4-6］。不同于传统的二维单层细胞培养,三维细胞培养技术(three dimensional cell culture,TDCC)是指使用三维支架或设备为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系．促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，形成一定的三维结构。三维细胞培养支架是组织工程技术的关键，它为细胞贴附、散布、迁移、增殖和分化提供结构支撑。支架要求孔隙率高，孔内部连通，以利于细胞的渗透、营养物质和氧气的输送以及组织的血管化；材料可生物降解，且细胞相容性好[7]；具有一定的机械强度，特别是用于承受一定压力的组织的修复[8]。前期学者研究表明P(3HB-co-4HB)材料有作为医学生物材料的潜力［9］，但是作为ES细胞的补片材料应用于干细胞移植治疗尚缺乏研究，本研究通过将拟胚体与P(3HB-co-4HB)材料补片共培养，观察细胞补片对ES细胞拟胚体生长及增殖的影响，以期找到适合细胞生长及增殖，具有良好的生物组织相容性和物理特性，并且在生物体内具有可吸收性的生物材料。1.材料与方法1.1材料实验于2014年7月至2015年2月在北京市心肺血管疾病研究所-省部共建心血管重塑重点实验室完成。（1）实验选取的清洁级昆明小白鼠购自首都医科大学附属北京安贞医院动物房。(2)干细胞来源：小鼠胚胎干细胞来自于上海生命科学院R1干细胞株。(3)主要试剂：1％非必需氨基酸、L谷氨酰胺、0．1 mmol／Lβ巯基乙醇、高糖改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)、青链霉素(Gibco公司)，丝裂霉素C(Sigma公司)，普通胎牛血清(FBS)、干细胞专用胎牛血清(ES qualified FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、0．05％胰酶、明胶、白血病抑制因子(LIF，Gibco公司)、即用型DAPI染色液（5μl/ml）。(4）聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯P(3HB-co-4HB)材料由清华大学化工系高分子研究所合成。1.2方法（1）小鼠胚胎纤维状细胞(MEF)的获取、传代、培养和处理：激素处理小鼠，雌雄合笼交配，取出妊娠12.5-14.5天的小鼠作为实验材料。颈椎脱颈法处死孕鼠，酒精消毒，解剖，无菌条件下取出胎鼠，PBS清洗。去除头，尾，内脏和四肢，仅保留躯干，用眼科剪将躯干剪成碎片，胰蛋白酶消化，离心，过滤，收集滤液，离心除去上清，重悬细胞，铺板，加人到含有10 ml MEF培养基的0．1％明胶处理过的10 cm培养皿中培养。第二天换液，随后每2天换液一次。培养5天后，MEF细胞接近汇合，1：3传代，继续培养，传至3代MEF细胞生长接近汇合时，用丝裂霉素C处理细胞。转移至T25培养瓶中铺板，为下一步的ES细胞培养作为滋养层细胞。MEF细胞培养基包含85％的DMEM培养基，13％的FBS，1％青、链霉素，1％L-谷氨酰胺。（2）小鼠胚胎干细胞的复苏、培养和传代：复苏ES细胞时，取出1支液氮冻存的细胞，在水浴锅内迅速融化(最好1 min之内)，然后加入到含有5 ml ES培养基的15 ml离心管中，1000r／min离心5 min，吸除含有二甲基亚砜(DMSO)的上清，重悬细胞转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。第二天换液，以后隔天换液。待细胞接近汇合时传代，小鼠胚胎干细胞以1：4传代。ES细胞培养基包含77％DMEM,20％干细胞专用FBS,1％非必需氨基酸,1％L-谷氨酰胺,1％青、链霉素，0．1％β巯基乙醇(0．1 mmol/L)，LIF因子（1000单位/mL）。（3）小鼠胚胎干细胞拟胚体(EB)的制备：ES细胞克隆长满后胰酶消化，离心后重悬。用细胞计数板计数，用不含LIF的培养基稀释到2×10 7／L，以20μl为1滴，每滴含400个细胞，悬滴于培养皿盖上培养2～3 d后(培养皿中加PBS)，形成EB。细胞补片制作:使用眼科剪将经过环氧乙烷消毒处理的生物膜裁剪成14mm直径的圆形片，本实验共制作10个，使用培养基浸润，等到完全被培养基浸润后使用PBS缓冲液冲洗3次，放入24孔板备用，保持生物膜表面平整，细胞种植前使用培养基进行浸润，24h后移去培养基，将拟胚体种至24孔板与补片共培养。每个14mm圆形三维生物材料表面种植5个EB。荧光标记法观察细胞补片：共培养48h后，将细胞补片置于载玻片上，DAPI液滴于补片上，加盖玻片于荧光倒置显微镜下观察并拍照，观察EB是否存活，以及拟胚体形态。激光共聚焦显微镜（Confocal）观察细胞补片：通过移动透镜系统对生长有EB的P(3HB-co-4HB)细胞补片进行三维扫描，观察拟胚体在细胞补片上的生长情况。取垂直与生物膜的轴面，锁定一个EB顶端与底端，经测量有2mm的厚度上，平均分成20个层面，经共聚焦显微镜扫描，取双通道观测，第一通道为细胞核显现象，主要用来观看细胞核；第二通道细胞核与三维生物膜都显像，激发光为绿色。主要用来观察P(3HB-co-4HB）这种生物材料，每个层次的拟胚体细胞核，EB与生物膜的生长关系，拍照记录。（7）扫描电镜标本制作:共培养的标本经去离子水洗涤3次后，使用0．25%戊二醛500μl固定，浸没细胞补片置于4℃保存，冷冻干燥脱水，经金属镀膜法制成扫描电镜标本后上机检测。拍照记录。2.结果光镜下的MEF细胞：光学显微镜观察可见原代MEF细胞在培养皿中成贴壁生长,以长梭形为主，少部分为多边形或不规则星形等形状,排列成漩涡状，栅栏状等，细胞大小不均匀,有卵圆形核。MEF细胞生长迅速，细胞生长每隔3、4天就接近汇合，传代一次，随着传代次数增加,杂质细胞减少,细胞成分逐渐趋向单一化。(a)500μm(b)200μm(c)100μm光镜下ES细胞的形态：光学显微镜下观察小鼠的胚胎干细胞形态。MEF细胞作为ES细胞的饲养层细胞，ES细胞和MEF细胞共同生长。观察可见ES细胞核大，有一个或几个核仁，胞质胞浆少，结构简单。在T25瓶中，细胞排列紧密，呈集落状生长。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。ES细胞生长迅速，细胞每隔5-7天就接近汇合，传代一次，用白血病抑制因子（LIF）抑制其分化，ES细胞的分裂能力不减，形态和原代培养时差别不大，呈现出多能干细胞的无限增值优势。(a)400μm(b)200μm(c)100μm荧光标记细胞补片①EB与P(3HB-co-4HB)共培养成为细胞补片。DAPI染色后经统计10个细胞补片表面的拟胚体全部经DAPI染色着色，ES细胞爬膜率为100%，细胞未出现凋亡，P(3HB-co-4HB)这种生物材料对胚胎干细胞没有伤害，ES细胞可在上面生长，繁殖。②由于P(3HB-co-4HB)这种三维材料为有机膜，可吸收一定量的染料，在倒置荧光显微镜下可显色，特意拍摄空白的P(3HB-co-4HB)三维膜，以做对比。可观察到生物膜的三维立体结构，丝状纤维较长，排列紧密，相互交错③观察拟胚体在生物膜表面生长，帖附，EB与生物膜连接紧密，形态正常(a)200μm(b)500μm(c)200μm(d)100μm（a）一个视野下面，拟胚体在膜上的生长(b～d)为选取一个拟胚体在不同的放大倍数下显像，着重观察EB与膜的关系Confocal（激光共聚焦显微镜）观察细胞补片①同样的，先在Confocal下任意选择一个层次拍摄空白膜结构，观察可见生物膜的三维立体结构，丝状纤维较长，连续性较好，排列紧密，相互交错，结构完整第1层拟胚体核显色，生物膜稀疏第5层拟胚体核显色变亮，生物膜增多第10层拟胚体核显色更亮，生物膜进一步增多第15层拟胚体核显色较10层变暗，生物膜逐渐消失第20层拟胚体核显色消失，生物膜消失，为细胞和膜的底端扫描电镜①取空白膜，电镜下观察P(3HB-co-4HB)材料形态(a)×100(b)×500(c)×1000②取细胞补片在电镜下观察，P(3HB-co-4HB)材料与ES细胞拟胚体共培养形成的细胞补片。③高倍数下观察可见ES细胞拟胚体形态正常，膜的纤维细丝穿过细胞，或在细胞的上方，包绕细胞，细胞与三维膜结合紧密，在膜上生长，形成细胞补片。(a)×400(b)×800(c)×1000结论心血管疾病是目前全球发病率最高的疾病，而其中心肌梗死（MI）的发病率最高，MI是由于冠状动脉狭窄或闭塞造成冠脉远端供血区域心肌缺血，目前治疗主要有内科保守溶栓抗凝治疗和外科的冠状动脉旁路移植术治疗两种比较有效的方法，但是两种治疗都只能够对缺血区的心肌供血有所改善而以往的研究表明心肌细胞是组织细胞分化的终末阶段，不可再生，心肌梗死后的缺血梗死区域的心肌细胞会被纤维组织代替，从而导致心脏射血功能下降，出现心功能衰竭，危及生命等，各种治疗手段都不能从根本上解决问题；又因心脏移植受心脏移植供体来源、移植物抗宿主病反应等方面的限制，给临床治疗带来困扰。随着细胞和组织工程研究的不断深入，干细胞移植技术成为治疗心血管疾病研究的热点。［10-12］目前，干细胞已经大范围的应用于心肌梗死的治疗及研究，并取得了令人振奋的初步研究成果，展示了广阔的临床应用前景。胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括心肌细胞。但是，将胚胎干细胞移植到心肌表面需要有良好的载体依托，以保证胚胎干细胞能够在心脏表面存活，增殖。因而，寻找一种能够为细胞提供良好生存环境，具有一定的物理学特性和良好的生物组织相容性，以及可体内降解吸收的材料，提高移植细胞在移植区域的存活和增殖，从而可以更好地改善疾病预后。聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯[P(3HB-co-4HB)]是一种能够完全降解的，具有良好生物相容性与环境友好性的热塑性高分子材料，它可由多种生物体在体内积聚形成。因其是一种新型的第3代PHA材料，且具有良好的物理性能引起了广泛的关注。清华大学化工系高分子研究所实验室研制并成功合成P(3HB-co-4HB)作为新型的组织工程材料。P(3HB-co-4HB)具有前材料的合适的物理化学性质，良好的生物组织相容性和可降解特性，研究表明P（3HB-co-4HB)呈现生物相容性及降解吸收特性比PHB更优越［13-14］。激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜都可以观察到细胞在补片表面ES细胞的生长和形态。纤维细丝穿过EB，或在细胞的上方，包绕细胞，ES细胞与三维膜结合紧密，在膜上生长，形成细胞补片。DAPI染色后经统计10个细胞补片表面的拟胚体全部经DAPI染色着色，细胞未凋亡，表明ES细胞在生物膜表面良好的生长。P(3HB-co-4HB)这种生物材料对ES细胞没有伤害，ES细胞可在上面生长，繁殖。该材料具有良好的生物组织相容性和降解特性，因此P(3HB-co-4HB)有希望成为干细胞治疗心肌梗死等多种疾病的支架材料之一。同时，本研究尚存在不足之处1.虽然ES细胞能够在P(3HB-co-4HB)材料制成的补片材料上存活、增殖，并且P(3HB-co-4HB)材料具有良好的生物组织相容性及可降解吸收特性，但是补片材料降解吸收后对机体的影响，以及补片材料的植入对机体免疫系统的影响等尚不明确，仍需进一步的研究。2.实验目的旨在证明ES细胞能在P(3HB-co-4HB)生物膜上生长，繁殖，形成细胞补片，以上数据检测已证实。但是如果能在三维生物膜上通过添加诱导剂诱导出能自发跳动的心肌细胞，这显然对心肌梗死坏死区域的治疗意义更大。References:［1］Carolyn J．Teng，Luo Jun，Ray C J，et al．Massive mechanical loss of microspheres with direct intra myocardial injection in the beating heart:Implications for cellular cardiomyoplasty．J ThoracCardiov Sur，2006，132(3):628-632．［2］Adil H A，Juan Francisco Asenjo，Yin Ge，et al．Microencapsulation to reduce mechanical loss of microspheres:implications in myocardial cell therapy．Euro J Cardio-ThoracSurg，2011，39(2):241-247．［3］Saito T，Kuang J Q，Lin C C，et al．Transcoronary implantationof bone marrow stromal cells ameliorates cardiac function after myocardial infarction Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery，2003，126(1):114-122．[4]Mandel Y，Weissman A，Sehick R，et a1．Human embryonic and inducedpluripotent stenl cell—derived cardiomyoeytes exhibit beat rate variability and power—law behavior[J]．Circulation，201 2，1 25(7)：883—893．[5]Shiba Y，Fernandes S，Zhu WZ，et a1．Human ES—cell—derived cardio．myocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts[J]．Nature，2012，489(7415)：322-325．[6]Gepstein L，Ding C，Rahnmtula D，et a1．In vivo assessment of theelect”physiological integration and arrhythmogenic risk of myocardialcell transplantation strategies[J]．Stem Cells，2010，28(12)：2151-2161．[7]Verma V，Verma P，Ray P，et a1．[J]．Materials Science&Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems，2008，28(8)：1441-1447．[8]Nazarov R，Jin H J，Kaplan D L．[J]．Biomacromolecules，2004，5(3)：718-726．[9］Torun K，Gand K F．Bone generation on P(3HB-CO-4HB)matrices:an in vitro study．Biomaterials，2003，24:4999-5007．[10]Blau HM，B razehon TR，W eim ann JM，et a1．The evolving concept of astem eell entity or function．Cell，2001，105：829—841．[11]Orlie D，Hill JM，Arai E，et a1．Stem cells for myocardial regeneration．Circ Res．2002．91：1092-1 102．[12]Roell W，Lewaher T，Sasse P，et a1．Engraftment of connexin43 expressing prevents post—infarct arrhythmia．Nature，2007，450：819．[13］Tobella L M，Btmster M，Pooley A．Biosynthesis of poly-beta-Hydroxyalkanoates by Sphingopyxis chilensis S37 and Wautersia sp．PZK cultured in cellulose pulp mill effluents containing 2，4，6-trichloro phenol．J Ind Microbiol Biotechnol，2005，32(9):397．[14］Thakor N，Trivedi U，Pate1 K C，et al．Biosynthesis of medium chain length poly(3-hydroxyalkanoates)(mcl-PHAs)by Comamonas testosteroni during cultivation on vegetable oils．Bioresour Technol，2005，96(17):1843．

体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维单层细胞培养,三维细胞培养技术(three dimensional cell culture,TDCC)是指使用三维支架或设备为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系．促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，形成一定的三维结构。三维细胞培养需要将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白充当生长支架,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,达到最大程度地模拟体内环境[1]。TDCC作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁,显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年国内外的研究者使用三维细胞培养技术在心肌细胞培养上做出了很大的努力。现对三维心肌细胞培养的研究进展进行综述。[2]三维细胞培养支架材料三维细胞培养支架是组织工程技术的关键，它为细胞贴附、散布、迁移、增殖和分化提供结构支撑[3]。支架要求孔隙率高，孔内部连通，以利于细胞的渗透、营养物质和氧气的输送以及组织的血管化；材料可生物降解，且细胞相容性好[4]；具有一定的机械强度，特别是用于承受一定压力的组织的修复[5]。自三维培养系统问世以来，第1代三维培养系统运用的是人工合成的生物高分子微纤维支架,比如聚乳酸羟基乙酸、壳多糖等,从而模拟三维微型生活环境，但合成高分子的降解产物可能危害细胞生长。随后主要以更接近体内的ECM如胶原蛋白作为生长支架,并且多用含有血清的培养基孵育细胞,但由于ECM和血清中包含大量未鉴定组分,这为三维培养介导的针对人体的干细胞临床治疗带来了风险。第2代三维培养技术,使用的是植入人体后无任何副作用并能被降解的聚脂羊毛作为“人工脉管”(artificial interstitium)代替ECM生长支架,并且运用完全不含血清的DMEM化学培养基培植干细胞,从而建立了完全可控制的生长环境[6-7],为干细胞临床治疗奠定了安全前提。人工脉管模拟体内环境,由细小的纤维、间隙和孔洞组成,氧气、激素和营养成分得以通过,而废物可以从里面过滤出来。这种可以充分模拟体内ECM功用的新型三维“脚手架”,使干细胞能够在上面生长、繁殖,在加入特定的形态发生素或生长因子后,还可使干细胞定向分化，为组织再生。[8]目前用于三维培养的材料按材料来源可分为两种，天然材料（明胶，胶原蛋白，透明质酸，纤维素，葡聚糖，壳聚糖，海藻酸钠等），和合成材料（多肽，人工合成的DNA,PLGA,PEG,PLA）,其中葡聚糖是最具明显优势，使用最广泛，为拥有明显优势的三维支架材料。[9]三维细胞培养支架的主要形式有水凝胶[10]、纤维[11]和多孔结构[12]3种，多孔微球支架因其高表面积、高效细胞扩增性和可注射性引起广泛关注。与传统细胞培养方法相比，微球培养技术在培养细胞方面具有许多优点，如能提供大的表面积、节省培养空间降低成本、能更好地模拟复杂的生理环境、便于悬浮培养和提高细胞的表型表达等[13-18]，因此是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，并且已经应用于细胞的大量培养中。2.三维细胞培养生物反应器生物反应器是三维细胞培养过程中最关键的设备。近年来，针对三维细胞培养的生物反应器研制进展迅速，种类多样，特点各异，以不同的方式提供给细胞最适宜的生长环境。第一代反应器是皮氏培养皿，相比静止培养皿其优势已得到展现。[19-20]进而出现了搅拌式生物反应器，这是一开发较早，在研究，生产中广泛应用的一类反应器，其最大优点是能培养各种类型的动物细胞，培养工艺容易放大，产品质量稳定，非常适合于工业化生产，在生物制品开发中潜力很大，配合微载体、多孔微球、罐注技术，可达到更好的细胞培养效果。中空纤维生物反应器也是一类开发较早和正在不断改进的生物反应器，它类似于模拟的血管一样，为培养细胞提供营养物质并运走代谢废物。旋转生物反应器（RCCS)是由美国宇航局(NASA)开发的一系列旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system，RCCS）[21]，该设备主要由控制装置和培养容器两部分组成。控制装置主要监测和控制温度、pH值、转速、溶氧含量、二氧化碳含量等，培养容器主要由内外两个圆筒组成，内、外筒可相对独立地旋转。相比普通系统而言，RCCS的一个最主要的优势是可以模拟微重力环境，进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养。RCCS的发明使三维细胞培养仪器技术又向前迈了一大步。Teo等[22]研究发现，灌注旋转生物反应器或高纵横转动容器等动态组织培养瓶比静态组织培养瓶培养三维细胞，能产生较高的存活率和显著庞大的细胞数（高达4×105个细胞/株）。此外，细胞在旋转生物反应器中，心肌肌钙蛋白T，重链α-和β-肌球蛋白的基因能更早期的表达，心肌肌钙蛋白-I阳性细胞的百分比更高且α-肌动蛋白的均匀性能更好的显现。由胚胎干细胞分化培养出高性能的三维心肌细胞结构，充满活力的灌注旋转生物反应器是很有帮助的。3.三维心肌细胞培养尽管目前临床上已可成功阻止和减轻心脏疾病，但心脏器质性损害的恢复仍是一个难题。三维心肌细胞移植被认为是一个很有前途的治疗心血管疾病的方法。常用的用来充当种子的细胞有以下5种，干细胞两种①胚胎干细胞：胚胎干细胞已经证实具有向心肌细胞分化的潜能，但是存在异体移植的免疫排斥问题，此外，人类胚胎干细胞移植还涉及伦理学方面的问题②骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下，能分化为骨、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞，是目前最有发展前景的种子细胞。其它种子细胞有三种①胎幼心肌细胞：胎幼心肌细胞是研究最早最广泛的种子细胞。但胎幼心肌细胞作为种子细胞其来源受到限制，并且存在异体移植带来的免疫排斥问题。②心脏自体细胞:心脏自体细胞移植有更大的潜力达到与自体心肌同步收缩，但是这种方法获得的心肌细胞肌丝排列紊乱，细胞无收缩功能。③骨骼肌卫星细胞：骨骼肌卫星细胞同样来源有限，纯化困难，而且其数量和有丝分裂的潜能随着年龄的增长进行性下降等问题。纵使种子种类很多，但是人们对于种子的提取，使用，技术等方面都存在着各种难题，同时对种子的认识也纯在一定的误区，如果想寻找一种稳定的，安全的，可控的能投入临床使用的种子细胞，仍需要大量的实验研究。Anton等[28]研究发现，周期性拉伸有助于成人胚胎干细胞在三维支架中存活，并可增加血管内循环的构建，这可能对增加心肌细胞在该支架上的生长分布以及胚胎干细胞的生长分化有促进性的作用。周期性拉伸也可以促进人胚胎干细胞的成熟，使ESC获得更多的成熟的表型，并在体外成为一个更成熟的跳动的拟胚体。诱导形成的心肌细胞能产生更快的收缩频率，钙离子流动的速度，以及更快的通过离子通道，意味着心肌细胞更有力，能更好地协调心肌收缩，证实了胚胎干细胞三维培养在周期性拉伸下能更好的生长，表达。三维心肌组织工程的建立，目的在于促进内皮细胞和肌肉细胞这两类细胞去构建心肌血管化[23]。近期，Lesman等[24]使用由胚胎干细胞（ESC），人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，小鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)衍生的心肌细胞开发三维心肌细胞结构，其中小鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)显示的特性类似于骨髓间充质干细胞（MSCs），将这些细胞接种到生物可降解的多孔支架材料上进行三维培养，然后所得到心肌结构移植在大鼠心脏上进行体内培养。使用这种新的三维组织培养方式获得的心肌组织的血液灌注量较过去的仅使用的ESC衍生的心肌细胞进行二维培养有了明显的增多。[25]魏国峰等[27]为实现小鼠胚胎干细胞的生长、分化，构建了小鼠胚胎干细胞-胶原复合体的三维培养体系，结果显示小鼠胚胎干细胞在该三维培养体系内生长、增殖状态良好，且能建立起细胞连接，并经诱导后细胞自发性分化为具有表达心肌蛋白cTn-T等特异性蛋白的心肌细胞。Hosseinkhani等[26]采用微米和纳米级的三维细胞培养系统培养心肌干细胞，观察到心肌干细胞在三维灌流培养系统中粘附、增殖的潜伏期显著高于二维静止培养，提示三维细胞培养技术为心肌细胞的再生，以及心脏疾病的治疗提供了有效的途径。4.总结与展望三维细胞培养无论是在支架还是在反应器上，从出现到现在已有了很大的进步，三维细胞培养技术以其具有模拟体内微环境的优势，现已在再生医学领域中广泛应用，但由于其技术理论，以及所需生物材料的不断发展，故其仍有待进一步完善。三维心肌细胞培养为心肌修复提供一新的思路，然而我们所关心的三维心肌细胞的培养主要存在的3个方面的问题，缺乏理想的种子细胞、支架材料需要进一步完善、三维化心肌的厚度和大小尚不能满足实际需要及血管化等等，这些问题的存在阻碍了现阶段心肌干细胞移植治疗心血管疾病的进程。相信随着再生医学，材料与高分子化学以及组织工程的进一步发展，心肌细胞的三维培养技术会成为临床上心肌修复的新的治疗手段。References:[1]ALAVI A．STUPACK D G．Cell survival in a three dimensional matrixI[J]．Metheds Enzymol，2007，426：85．101．[2]PAMPALONI F,REYNAUD E G．STELZER E H．The thifd dimension bridges the gap between cell culture and live tissue[J]．Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(10)：839-845．[3]Hutmacher DW．[J]．Biomaterials，2000，21(24)：2529—2543．[4]Verma V，Verma P，Ray P，et a1．[J]．Materials Science&Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems，2008，28(8)：1441-1447．[5]Nazarov R，Jin H J，Kaplan D L．[J]．Biomacromolecules，2004，5(3)：718-726．[6]PAMPALONIF，REYNAUDEG，STELzER E H．The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue[J]．Nat Rev Mol Cell Biol，2007,8(10)：839-845．[7]MINUTHWW,HUK,DENKL.Kontrolliertes environment farstammzellen-generierung reualcr tubuli in chemisch definiertem kulturmedium[G]．Bioforum,2007：p28-29．[8]胡康洪，姚颖.三维细胞培养技术的研究与应用.[J].Med Mol Biol，2008，5(2)：185-188[9]]朱长皓，张天柱，胡克，等．功能化葡聚糖用于三维细胞培养及发展前景[J]．东南大学学报：医学版，2013，32(1)：8O一84[10]NILSANG S，NEHRU V，PLIEVA F M，et a1．Three-dimensional culture for monoclonalantibody production by hybridoma cells immobilized in macroporous gel particles[J]．BiotechnolProg，2008，24(5)：I122-1131．[11]徐飞，王大伟，陈双峰．电纺PLLA／PVP纳米纤维膜材料用于血管组织工程的前期研究[J]．东南大学学报：医学版，2011，30(3)：391—401．[12]KAUSHAL S，AMIEL G E，GULESERIAN K J，et a1．Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo[J]．Nat Med，2001，7(9)：1035-1O40．[13]THISSEN H，CHANG K Y，TEBB T A，et a1．Synthetic biodegradable micropartieles for articular cartilage tissue engineering[J]．J Biomed Mater Res Part A，2006，77A(3)：590—598．[14]MALDA J，FRONDOZA C G．Microcarriers in the engineering of cartilage and bone[J]．Trends Biotechnol，2006，24(7)：299-304．[15]HONG Y，GAO C Y，XIE Y，et a1．Collagen-coated polylactide microspheres as chondrocyte microcarriers[J]．Biomaterials，2005，26(32)：6305—6313．[13]KATO D，TAKEUCHI M，SAKURAI T，et a1．The design of polymer microcarrier surfaces for enhanced cell growth[J]．Biomaterials，2003，24(23)：4253-4264．[16]MALDA J，KREIJVELD E，TEMENOFF J S，et a1．Expansion of human nasal chondrocytes on macroporous microcarriers enhances redifferentiation[J]．Biomaterials，2003，24(28)：5153-5161．[17]KIM H W，GU H J，LEE H H．Microspheres of collagen-apatite nanocomposites with osteogenic potential for tissue engineering[J]．Tissue Eng，2007，13(5)：965—973．[18]MELERO-MARTIN J M，DOWLING M A，SMITH M，et a1．Expansion of chondroprogenitor cells on macroporous microcarriers as an alternative to conventional monolayer systems[J]．Biomaterials，2006，27(15)：2970—2979．[19]Freed L，Marquis J，Vunjak G，Emmanual J，Langer R．Composition of cell-polymer cartilage implants．BiotechnolBioeng 1994；43：605—14．[20]Vunjak-Novakovic G，Freed L，Bimn R，langer R．Effects of mixing on tissue engineered cartilage．AIChE J 1996；42：850-60．[21]Shuguang Zhang，Fabrizio Gelain，Xiaojun Zhao．Designer self-assembling peptide nanofiber scafodsfor 3D tissue cell cultures，Cancer Biology 2005，7(15)：413-420[22]Teo A,Mantalaris A,Song K,et al.A novel perfused rotary bioreactor for cardiomyogenesis of embryonic stem cells.[J].Biotechnol Lett,2014,36(5):947-960.[23]Avci-Adali M,Paul A,Ziemer G,Wendel HP.New strategies for in vivo tissue engineering by mimicry of homing factors for self-endothelialisation of blood contacting materials.[J].Biomaterials.2008;29(29):3936–3945[24]Lesman A,Habib M,Caspi O,et al.Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle.[J].Tissue Engineering A.2010;16(1):115–125[25]Muscari C,Giordano E,Bonafe F,et al.Strategies affording prevascularized cell-based constructs for myocardial tissue engineering.[J].Stem Cells Int,2014,2014:434169.[26]Hosseinkhani H，Hosseinkhani M，Hattori S，et a1．Microand nano-scale in vitro 3D culture system for cardiacstem cells[J]．J Biomed Mater Res A，2010，93(1)：1-8．[27]魏国峰，李向东，张维疆，等．体外构建胚胎干细胞生长分化的三维培养模型[J]．基础医学与临床，2008，28(3)：265—268．[28]Anton Mihic,Jiao Li，Yasuo Miyagi et cl.The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes[J].Biomaterials，2014，35：798-808.

主动脉穿通性溃疡是指主动脉粥样硬化斑块穿透内膜或内弹力板，破入中膜的主动脉疾患，一般伴有主动脉壁内血肿，可形成假性动脉瘤、主动脉夹层、动脉瘤甚至破裂[1]。临床上比较少见，巨大主动脉穿通性溃疡更是少见，现报告一例。临床资料 患者 男性，74岁，主因突发胸部持续撕裂样疼痛入院，一般情况良好，无心慌、气促，无胸闷、咯血，无双下肢水肿。查体：体温36.5℃，心率100次/分，呼吸20次/分，血压180/100mmHg。发育正常，皮肤黏膜无紫绀，颈静脉无怒张，心前区无明显隆起，心尖搏动位于左锁骨中线上第五肋间。各瓣膜听诊区未闻及杂及心包摩擦音。心电图示：大致正常心电图。超声心动图所见：左室增大，余心腔内径正常范围。各室壁厚度及运动正常。各瓣膜形态及运动未见异常，CDFI:舒张期主动脉瓣下见中量返流信号，缩流颈5mm。收缩期二尖瓣房侧见少量返流信号。收缩期三尖瓣房侧见少量返流信号。主动脉窦部及升主动脉增宽，其内未见明显剥脱内膜回声。肺动脉未见异常。胸骨上窝切面显示不清。初步诊断为：1、降主动脉穿通性溃疡 2、主动脉窦及升主动脉增宽 3、左室增大 4、主动脉瓣返流 5、二尖瓣返流 6、三尖瓣返流 7、心功能三级入院时伴有持续性的撕裂样胸痛，血压180/100mmHg,给予吗啡镇痛，硝普钠降压。将患者血压维持在90/60mmHg左右，心率60次/分，待急性期过去，血流动力学平稳，溃疡斑块稳定，血肿减小并稳定时经股动脉穿刺行降主动脉覆膜支架植入术，术中操作顺利，术后患者疼痛缓解，循环稳定，恢复顺利，痊愈出院。讨论 主动脉穿通性溃疡是主动脉粥样硬化斑块穿透内膜或内弹力板，破入中膜的主动脉疾患，一般伴有主动脉壁内血肿，可形成假性动脉瘤、主动脉夹层、动脉瘤甚至破裂。其临床症状与主动脉夹层类似，都有程度不同的胸背部疼痛，发病的平均年龄较主动脉夹层大，常见于60岁以上的老年患者，多有高血压及弥漫性动脉粥样硬化和钙化，好发于降主动脉[2-3]，较少见于升主动脉，但后者的预后较前者差，更易发生夹层或破裂。1934年Shennan等[4]首次描述了主动脉穿通性溃疡，1986年Stanson 等[1]进一步明确了PAU的特点和定义。动脉粥样斑块溃疡开始于内膜，一旦形成，溃疡可保持不变或进一步进展形成动脉瘤，穿破内弹力板形成壁内血肿及不同程度的夹层，穿破动脉壁形成假性动脉瘤或破裂，危险很高。目前主动脉穿通性溃疡的自然预后仍有争议。Harris等[4]认为主动脉穿通性溃疡进展缓慢，发生破裂等威胁生命的并发症几率较低，但大部分报道[5-6]认为主动脉穿通性溃疡预后不良，比主动脉夹层更差，有症状的急性患者约40%-50%可形成主动脉夹层或破裂，严重威胁患者生命。目前来说，主动脉穿通性溃疡一旦明确诊断后需要密切随访，首次发病一个月内应仔细观察临床症状及影像学资料，并进行内科降压等基础治疗，若出现持续性胸痛，胸腔积液有增多趋势及溃疡增大的患者，需要及时进行外科等干预治疗，以预防和减少并发症的发生。以往主动脉穿通性溃疡的治疗主要以外科手术为主，手术治疗主动脉穿通性溃疡的死亡率为5-20%，急诊手术死亡率更高，并且由于患者年龄大，常伴有肺动脉异常、肾功能不全或其他严重并发症者而不适合行外科手术。自90年代应用支架置入治疗主动脉疾患以来[7,8]，包括主动脉穿通性溃疡，由于创伤小，并发症少，安全有效，其应用越来越受到重视，逐渐成为一些主动脉疾病外科手术的替代选择。本例患者为巨大降主动脉穿通性溃疡，入院时伴有持续性的撕裂样胸痛，血压180/100mmHg,给予吗啡镇痛，硝普钠降压。将患者血压维持在90/60mmHg左右，心率60次/分，待急性期过去，血流动力学平稳，溃疡斑块稳定，血肿减小并稳定时经股动脉穿刺行降主动脉覆膜支架植入术，术中操作顺利，术后患者疼痛缓解，循环稳定，恢复顺利，痊愈出院。对于主动脉穿通性溃疡的治疗，目前认为治疗策略为：无症状慢性PAU，密切临床和影像学随访。以下情况及时介入或外科治疗：持续胸痛或复发疼痛；溃疡直径大于20mm或深度大于10mm；随访过程中溃疡加深加大；动脉瘤形成或夹层形成；即将破裂：血液大量外渗如胸腔等。本例患者持续性胸痛存在，血流动力学不稳定，随时有形成夹层及破裂的可能，且在急性期内，因此调整一周后再行降主动脉覆膜支架植入术，效果确切，病人恢复顺利，未发生任何并发症，痊愈出院。对于这种巨大的降主动脉穿通性溃疡，若无明显禁忌，应予急性期稳定病情，待急性期过后及时予以介入治疗，效果明显。

临床资料患者，男，60岁。因“心慌憋气伴胸疼1年，加重1个月”入院。查体：体温36.4℃，脉搏80次/分，呼吸20次/分，血压120/70mmHg。双下肢有轻度水肿。心电图示：正常窦性心律。胸片示:两肺纹理清晰，左室增大，心胸比率0.56，两膈面光滑，膈角可辨。超声心动图显示：主动脉瓣下探及半环形膜性结构，范围约42*6mm，前室间隔基底段增厚，最厚处18mm，凸出左室流出道，上述因素导致主动脉瓣下狭窄，最窄处内径8mm，CDFI：局部血流五彩镶嵌，CW测局部血流速度：388cm/s,压差68mmHg。主动脉瓣三瓣缘增厚，回声增强。CW：主动脉瓣上流速：336cm/s,压差32mmHg。CDFI：舒张期主动脉瓣下见少量返流信号。其它常规检查未见异常。入院诊断：1.主动脉瓣下狭窄。2.左室肥厚，室间隔基底段为著。3.主动脉瓣上流速增快伴反流。患者入院后完善各种检查，明确诊断和手术适应症，排除手术禁忌证后，于2014年3月行主动脉瓣下狭窄切除术。常规消毒，全身麻醉，胸部正中切口进入心包腔，建立体外循环，中度低温，升主动脉前壁作横切口，探察主动脉瓣叶结构正常，关闭良好。用小钩轻轻拉开主动脉瓣，可见瓣下狭窄环，狭窄环为呈环形的隔膜，范围约60×8×5mm，围绕左心室流出道(图1)。首先从室间隔侧找出内侧缘，继续向后、外沿环，轻轻提起狭窄予以切断，向两侧剪除增厚的狭窄环，在左室隔侧切除时注意勿损伤室间隔，以免造成穿孔，另外勿损伤传导束。切除室间隔表面的隔膜时要表浅，不应过深。尽可能的切除纤维性增厚的狭窄组织，切除后左心室流出道可顺利通过示指。术中要注意勿损伤主动脉瓣，手术全程均应注意勿过度牵拉主动脉瓣，以免产生关闭不全。术后病理检查：切除狭窄环组织大体标本约50×7×3mm，病变组织呈纤维组织增厚，玻璃羊变性钙化；有部分心肌细胞组织萎缩变性。病理诊断为主动脉瓣下狭窄。术后病人恢复良好，术后7天痊愈出院。术后7天复查超声心动图示心功能良好，心脏未见异常。心电图为正常窦性心律。心脏平片示正常心影大小。讨论先天性主动脉瓣下狭窄男性约为女性的3倍，在先天性左室流出道梗阻的病例中约占3%-8%，仅次于主动脉瓣狭窄，不包括特发性肥厚性心肌病左室流出道梗阻。它有两种常见的类型：1.局限型动脉瓣下狭窄，又包括隔膜样瓣下狭窄，是主动脉瓣下约1.0-1.5cm有纤维性隔膜造成狭窄，和纤维肌隔样瓣下狭窄。2.弥漫型主动脉瓣下狭窄，是左心室流出道肌肉弥漫型增厚造成的管状狭窄，又称为隧道性瓣下狭窄。本病常合并其他畸形如动脉导管未闭、主动脉缩窄、主动脉弓离断、室间隔缺损和主动脉瓣畸形，合并主动脉瓣狭窄最多见约占50%-60%[1]。本例为局限性动脉瓣下狭窄，同时合并主动脉瓣上流速增快伴反流。关于本病的病因并不十分明确，可由先天因素或心肌异常肥厚引起。先天性主动脉瓣下狭窄是1种少见的先天畸形，约占先天性心脏病的0.5%。在正常发育情况下,心球大部退化,其左侧部分则融入右室漏斗部,如果因任何原因导致心球未能退化则产生瓣下阻塞。主动脉瓣下狭窄病例,主动脉瓣大多正常，呈三瓣叶型。有的病例瓣叶稍增厚,或并有轻度关闭不全。少数病人可兼有双瓣型主动脉瓣狭窄。左心室心肌呈现高度向心性肥厚,心内膜下血供不足可引致心肌纤维化。有时心室间隔心肌肥厚程度较左心室后壁更为显著，易与阻塞性肥厚性心肌病相混淆,主动脉瓣下纤维狭窄约有1/3病例伴有其它先天性心脏血管畸形，常见者有心室间隔缺损、主动脉弓中断,动脉导管未闭、法乐四联症、心房间隔缺损,肺动脉瓣狭窄或右心室流道狭窄等[2，3]。手术指征：无症状的婴幼儿不需外科治疗，只有当狭窄处收缩压力阶差>50mmHg，心电图表现为严重的左心室肥厚、劳损，或继发感染件心内膜炎时才应行外科治疗。发生左心衰竭和猝死者多有合并畸形，应积极手术。有学者认为局限型主动脉瓣下狭窄的病理改变呈进行性加重，随手术年龄的增长，合并动脉瓣关闭不全的发生率及程度均增加，所以认为诊断一经确定均应极手术治治疗[4,5]。一般本病发生在婴幼儿，即进行手术治疗。本病例为老年患者，主动脉瓣下重度狭窄合并主动脉瓣上流速增快伴反流病例，主动脉为正常三叶，未合并其他心脏畸形；考虑为随年龄增大，瓣下纤维组织持续增厚，同时引起继发性室间隔肌肉增厚，使左室流出道狭窄，同时，主动脉瓣上流速增快伴反流，加重病情发展。由于狭窄持续发展，出现明显心慌气短症状，严重影响生活，需要进行手术治疗。切除完成纤维狭窄组织环，临床治疗效果满意，完全消除临床症状。虽然患者为老年60岁，临床上进行手术矫正畸形仍然安全可行。

临床资料患者，男，50岁。因“陈旧性心肌梗塞”入院。患者2年前无明显诱因出现心前区不适，伴有心慌，于当地医院进行检查，心电图提示心肌梗塞，迅速到和河北省人民医院进行住院治疗，做冠脉造影，提示矫正型大动

肾脏移植,冠状动脉旁路移植术,心脏瓣膜置换术都是常规手术。对于临床上终末期肾脏疾病患者，动脉粥样硬化性心脏病其是死亡的主要原因。一些研究报道：对于那些终末期肾脏疾病患者，心脏手术能改善症状，并且呈现出低死亡率。但是，在肾脏移植后进行心脏手术，对肾脏移植后患者肾功能的影响，以及手术并发症发生率和死亡率的影响，手术和免疫抑制治疗的安全性和有效性，目前尚未见详细的研究报道。现将我科自2011年以来6例肾脏移植术后患者行心脏手术的临床资料总结如下。资料与方法1．病人资料2011年1月至2013年10月间，我科对6例肾脏移植术后的患者施行心脏手术治疗，4例为男性,其余2例为女性；冠心病2例，主动脉瓣膜狭窄并关闭不全3例，二尖瓣关闭不全1例。年龄在27岁~66岁，平均（42±14）岁；体重44~78 kg,平均（58±15）Kg;体表面积1.4~1.7 m2,平均（1.5±0.1）m2；60岁以上者1例。合并起搏器植入1例，高血压病1例，糖尿病1例，陈旧性脑梗1例。纽约心脏病协会（NYHA）心力衰竭分级Ⅲ级以上者3例。所有患者均有心悸、气促和胸闷等症状。所有患者都有肾脏移植病史，距离手术时间为6~10年，平均（8.5±1.7）年。2 手术及免疫抑制治疗方法入院后给予常规治疗，完善各种检查。患者住院后继续服用肾移植术后长期服用的免疫抑制药物，具体为新赛斯平（环孢素胶囊）50mg,1日2次，晓悉（吗替麦考酚酯）0.25g,1日2次。完善各种检查，明确诊断和手术适应症，排除手术禁忌证后，行手术治疗。所有患者都于术前当天新赛斯平（环孢素胶囊）50mg和晓悉（吗替麦考酚酯）0.25g口服。以芬太尼和异丙酚为基础的静脉和吸入复合麻醉，气管插管，标准胸骨正中切口下进行手术。患者在全身麻醉后常规胸骨正中开胸，手术在中度低温体外循环心脏停跳下完成，升动脉阻断后，含血冷停跳液保护心脏。施行常规二尖瓣或者主动脉瓣置换；或者在非体外循环心脏跳动下，进行冠状动脉旁路移植手术。所有患者都于术中静脉给予甲强龙500mg，3 统计学处理临床资料以x±s表示，用t检验或者x2检验。数据使用SPSS16.0统计软件包进行统计分析，P<0.05< span="">为有统计学意义。结果结果全组无1例死亡，无并发症，均痊愈出院。3例行主动脉瓣置换术，1例行二尖瓣置换术，2例行冠脉旁路移植术。所有6例患者都于手术后第1天拔除气管插管；除1例患者第2天转出ICU外，其余均当天转出ICU；住院时间11~26d，平均（17±6）d；本组病例体外循环时间 (101.3±16.7)min，循环阻断时间(75.6±9.7)min；本组病例的术前与术后左心室射血分数分别为(63.5±4.5)%与(56.5±5.8)%（P＜0.05）；术前和术后的左心室舒张末径大小分别为(54.5±8.5)mm与(43.7±6.8)mm（P<0.05< span="">）；术前术后左心室射血分数和术前术后左心室舒张末径大小指标比较，差异都有统计学意义。所有患者都于术后当天静脉给予加强龙150mg，连续3天。术后第1天，继续开始服用新赛斯平（环孢素胶囊）50mg,1日2次，晓悉（吗替麦考酚酯）0.25g,1日2次。本组病例的术前与术后肌酐CREA分别为(103.7±15.1)umol/l与(106.6±34.7)umol/l（P﹥0.05）；术前术后肌酐指标比较，差异没有统计学意义。随访6例，随访时间4~15个月，治疗效果良好，心功能均达Ⅰ～Ⅱ级，生活质量较术前明显提高。讨论肾脏移植后免疫抑制治疗进行心脏手术，还有其伴随的动静脉通路，增加了心内膜炎等感染的发生率。在肾脏移植后，是否能够承受体外循环带来的创伤和生理改变？在免疫抑制治疗中，心脏手术是否增加排斥和感染的机会，或者影响伤口的愈合[1]。面临上述问题，肾脏移植后进行心脏手术，目前没有这方面的详细报道[2,3]。由于长期的免疫抑制剂治疗，感染是肾移植病人最让人担忧的手术并发症，所以一定要控制好血糖和正确使用抗生素，及早下床活动和加强呼吸道护理也很重要。心脏手术增加了很多感染因素，如组织创伤、术野的长期暴露、体外循环带来的生理改变等。这些危险因素和长期的免疫抑制治疗都增加了感染的发生率。为了防止体外循环对移植肾脏的损害，对于冠心病行冠状动脉旁路移植术，采用非体外循环心脏跳动下进行，没有体外循环带来的一系列心肺脑肾和血液系统的损害，对病人更安全。本研究中，对于2例冠状动脉旁路移植术患者，应用OPCABG，手术安全，术后恢复顺利。但是，对于心内膜炎的瓣膜病人，有肾脏移植的免疫抑制治疗，进行心脏手术，大大地增加了感染的发生率。本研究中，4例瓣膜病患者，没有心内膜炎的病史。但是，由于免疫移植的长期治疗，仍然可能增加感染的发生率。所以正确的围术期处理非常关键。肾脏移植术后行瓣膜置换术的患者，围术期因该加强肾功能支持，术前护肾，术中避免心肺转流导致的低血压，缺血缺氧及肾脏低灌注。尽量缩短体外循环时间，同时在转流中保持较高的灌注压，保证体外循环中持续有尿。术后加强对肾功能持续检测。因为心肺转流预充液导致血液稀释，大量水分渗出到外周组织引起水钠储留，因此术后适当利尿，降低肾脏血管阻力，增加肾脏血流量，改变肾脏皮质内血流分布，更好地保护肾脏。本研究中，对于4例瓣膜置换术患者，正确处理，使所有患者术前和术后没有感染的发生；并且肾功能都维持正常范围内，所有患者都没有并发症的出现，均痊愈出院。肾移植术后患者，长期服用免疫抑制药物，这增加了手术的风险和难度，我们通过在术中静脉给予500mg的甲强龙以及术后连续三天静脉给予150mg甲强龙的方法，来抑制免疫排斥反应，同时发挥其在术中抗炎、抗过敏的作用[4]。对于一些特殊情况，应该特别地处理。如对于术中出现的主动脉管壁薄脆引起多处渗血的情况，分析推测其与患者长期服用免疫抑制药物相关，这种情况下涤纶片固定包绕主动脉壁的方法具有很好的大范围压迫止血效果，这在术中和术后都得到了证实。通过持续的免疫抑制治疗，手术中的排斥反应被有效地控制。在围术期，肾脏功能指标被检测，没有明显的变化。本研究中，血清肌酐水平术后没有明显升高表现，维持术前水平，在术后第5天左右，与术前相比，没有统计学差异；在持续的术前免疫抑制治疗中，也没有出现术后的免疫排斥反应。这些结果，与以往文献报道一致[5]。心脏病（包括瓣膜病和冠心病）合并肾移植术后的病人，有明确的手术适应症，给予瓣膜置换手术或者冠状动脉旁路移植术。只要术前和术后给予正确的免疫排斥药物及激素得到正确应用[4]，可以避免术中术后急性排斥反应的发生。心脏病（包括瓣膜病和冠心病）合并肾移植术后的病例进行心脏手术未见详细的报道，本病例对于肾移植术后的瓣置换术或者实施冠状动脉旁路移植术，以及围手术期免疫排斥问题的应对具有很高的参考意义。我们认为只要正确的方法进行手术和围术期管理，肾脏移植病人可以完全地接受心脏手术。

一．iPS细胞的发现及研究历程诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,IPS细胞）是通过将转录因子导入已分化的体细胞中重编程形成的，和胚胎干细胞类似，具有广泛的全能性，所不同的是诱导多能干细胞不需要通过胚胎组织产生，因此避免了伦理道德问题。更重要的是诱导多能干细胞具有多组织分化潜能，能在体外分化成所有三胚层细胞，因此在临床医学、再生医学领域都有广泛的应用。IPS细胞从产生至今日，一直受到科学家的广泛关注，近年来科学家们致力于研究如何更有效、更安全的产生诱导多能干细胞，并取得了重大的进展。2012年10月，山中伸弥博士凭借在IPS领域做出的巨大贡献获得了诺贝尔生理或医学奖。2006年，日本科学家Yamanaka【1】研究小组首次发现将4 种转录因子Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4转入小鼠成纤维细胞，可获得具有全能性的诱导多能干细胞。2007年，山中伸弥【2】小组将四种因子转入人体细胞中重编程为诱导多能干细胞。2007年12月，2007 年12 月, Thomson 等【3】筛选出了另外一套用于诱导的基因组合—Oct4、Sox2、Nanog 和Lin28。随后, 他们利用这4 种因子使人类新生儿成纤维细胞重编程为iPS 细胞【3】。这两项发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007 年第一和第二大科学进展。2008 年4 月, Schenke-Layland 等【4】将鼠皮肤细胞重编程为iPS 细胞, 并成功地使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。2009 年2 月, 日本东京大学研究人员在培养iPS细胞的时候添加人类骨髓细胞以及催进细胞增殖的蛋白质等物质使iPS 细胞分化成了血小板的前身巨核细胞, 进一步培育出血小板, 同时也从技术上说明了用iPS 细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。2009 年3 月, iPS 细胞研究相继迎来两项重大突破。3 月1日, Nagy 研究组和Kaji 小组[5, 6]采用转座子介导的方法高效率制备了virus-free 鼠iPS 细胞,获得iPS 细胞后, 又成功将先前导入的转录因子基因从iPS 细胞中移除。3 月6日, Jaenisch 小组[7]将移除外源基因的人iPS 细胞成功诱导成多巴胺神经元, 且神经元细胞的基本功能不受影响。iPS细胞产生大致步骤：（1）分离和培养宿主细胞（2）将几个重要的全能性因子通过病毒转染的方式导入宿主细胞（3）将病毒转染的细胞在ES培养体系中培养，并在培养液中加入小分子化合物促进重编程（4）出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定（细胞形态，表观遗传学，全基因表达谱，全能性等方面）目前获得iPS细胞的技术已经成熟，科学家们已经从多种动物的的体细胞中诱导产生了iPS细胞。二．iPS细胞安全性的提高科学家们在制备iPS细胞过程中发现，全能性相关基因c-Myc具有致癌作用，这使得iPS细胞的应用受到限制。2009 年10 月，丁盛博士［8］针对iPS 细胞的潜在危害问题，建立了一种诱导多功能干细胞的新方法。他利用纯化的蛋白将成体细胞转化为最原始的胚胎样细胞，从而避免了插入基因带来的危害。2012 年，Yamanaka研究小组发现，用与c-Myc基因结构类似的基因L-Myc来替代c-Myc基因，同其它三个基因一起用病毒转染的方式导入宿主细胞，同样可以获得iPS细胞，继续培养，使iPS细胞分化为生殖细胞，并培育出实验小鼠，且几乎没有发现肿瘤，另外iPS细胞的诱导效率提高了将近三倍。这一报道对提高iPS细胞诱导效率以及解决iPS细胞发育成癌细胞的问题具有重要的意义。现在经过各国科学家的不懈努力，研究出更多、更安全、更有效的产生iPS细胞的方法，使用的因子越来越少，有的甚至只需要小分子化合物就足以产生iPS细胞，虽然转化效率有待提高，但是其安全性及便利性有目共睹。三．最新iPS细胞的诱导方法在早期的研究当中，人们通常利用逆转录病毒为载体将四因子导入分化细胞，但是，这种方法很有可能导致外源基因插入细胞的基因组中，引起插入突变，存在很大的弊端。因此，人们开始尝试利用其他小分子基因转染的方法。Stadtfeld等【9】利用腺病毒载体成功诱导了小鼠iPS细胞的产生，Okita等【10】利用脂质体转染的方法建立了小鼠的iPS细胞，Huangfu等【11】发现在诱导人iPS细胞过程中，可以用一种小分子物质代替以往使用的一种癌基因，即只需要转染两个基因就可以成功得到iPS细胞。这三种无需逆转录病毒载体诱导iPS细胞的策略避免了使用逆转录病毒载体所带来的基因插入、整合、突变等问题。另外一些研究发现，一些细胞如小鼠的神经干细胞和神经前体细胞，其本身高表达Sox2,c-Myc和Klf4，因此可以只用Oct4和Klf两种转录因子，甚至只用Oct4一个转录因子就可将其重编程成iPSCs【12-14】。最近邓宏魁组【15】报到，仅仅用七种小分子化学物质诱导出了iPS细胞。他们先前发现使用“VC6T”【VPA,CHIR99021(CHIR), 616452,Tranylcypromine】和Oct4（6）可以促进重编程，之后在筛选了10000个小分子化合物后，确定了Forskolin(FSK), 2-methy-5-hydroxytryptamine (2-Me-5HT), and D4476能够替代Oct4，因此仅仅加入这七种化学物质即（VC6TF）可产生一些GFP阳性的克隆细胞，且能够表达钙黏蛋白，但是并没有产生iPS细胞。在加入DZNep之后，出现了iPS细胞，之后他们发现四种小分子物质【15】在诱导产生iPS细胞过程中是非常关键的，这四种物质(C6FZ)包括：CHIP(C),616452，FSK(F)和DZNep(Z)。四．提高iPS细胞的重编程效率的方法在最初的研究中，iPS细胞的重编程小效率只有0.01%左右【1】；其他一些研究中重编程的效率更低，有的甚至还不到0.001%。在提高iPS细胞安全性的一些方法中往往会伴随着重编程效率的下降，因此提高iPS细胞重编程的效率是非常重要的一点。1 选择合适的供体细胞和不同的转录因子不同类型的细胞分化潜能不同，因此重编程的诱导反应也不同。选择合适的细胞来进行诱导能够提高重编程效率。用逆转录病毒介导表达Yamanaka因子，人幼年角质形成细胞获得iPS细胞的效率比成纤维细胞建立iPS细胞的效率高至少100倍，且出现克隆的速度也提高了2倍【16】。Suna等【17】发现脂肪干细胞以Yamanaka因子重编程的效率能达到0.2%，是同等条件下批复成纤维细胞的20倍。Li等【18】的研究中羊水细胞中的一部分特殊细胞类群在病毒介导的Yamanaka因子诱导下克隆形成率最高可达1.525%，且第四天就出现了iPS细胞克隆。不同因子的优化、组合也能提高重编程效率，也可配合使用其他相应的因子。Liao等【19】用Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和Klf4等6个转录因子转染细胞可提高重编程效率10倍左右。Mali等【20】将SV40大T抗原基因与Yamanaka因子共同感染人成体纤维细胞和胎儿成纤维细胞，可以将重编程效率提高23-70倍。而同时导入UTF1因子和下调p53表达水平的RNAi可增加Yamanaka因子重编程效率近100倍【21】。2 影响表观修饰或者信号转导作用在获取iPS细胞时，配合转录因子使用一些小分子化合物、蛋白质常能提高重编程效率，这是目前提高重编程效率较常用的方式。这些物质大致可以分为两种：影响表观遗传修饰的小分子化合物、蛋白质等，以及影响信号转导通路的小分子化合物。它们的作用体现在两个方面:一是提高重编程效率，二是替代某些转录因子。组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-0129可替代Oct4，并与其余三个Yamanaka因子一起重编程神经干细胞形成iPS细胞。此外，还可提高Oct4和Klf4两个因子重编程神经干细胞的效率【22】。此外还有很多提高重编程效率的化合物，例如BayK8644【23】可补偿Sox2的缺失带来的影响，在重编程过程中使用组蛋白去乙酰化抑制剂VPA，即使只是用Oct4和Sox2两个因子，也可把人成纤维细胞重编程为iPS细胞，不仅如此，VPA还能提高Yamanaka因子重编程小鼠成纤维细胞的效率至10%左右。另外，Esteban等【24】发现，在培养皿中添加维生素C可使iPS细胞重编程效率提高10倍，Yamanaka小组【25】发现，把培养环境的氧浓度从21%降到5%，人体皮肤细胞的重编程效率可提高到原来的2.5倍4.2倍。五．iPS细胞的筛选最初，Yamanaka小组用Fbx15作为筛选iPS细胞的报告基因，虽然它在小鼠ES细胞和早期胚胎中有着非常特异的表达，但是通过这种筛选策略得到的细胞在基因表达模式和DNA甲基化模式上都与ES细胞有所不同，且无法产生发育到期的嵌合小鼠。之后Yamanaka小组【26】以及Maherali【27】和Wering【28】等人利用基因重组技术建立了具有药物抗性基因的小鼠成纤维细胞，这些细胞的抗性受内源性Nanog或Oct4表达的调控，Wering等人比较了Nanog和Oct4的筛选效果，发现利用Oct4选出的抗性细胞比利用Nanog选出的细胞在数量上少很多，但前者中获得ES细胞特性的细胞比后者多，这一结果提示，在作为评判多能性的标准方面，Oct4的激活比Nanog的激活更为严格。六．iPS细胞研究所面对的问题iPS细胞的出现给干细胞研究领域带来了新的理念和技术，在再生医学有广泛的应用价值，然而我们还有许多未解决的问题，限制着iPS细胞的临床应用。仅仅几个因子的的导入是如何能够诱导体细胞发生重编程而具有多能性？为何iPS细胞的产生效率如此低？iPS细胞为何能够实现正常的分化等等。七．iPS细胞研究应用的前景从iPS细胞首次在动物中诞生，到建立方法的逐渐完善，再到iPS细胞研究在人类细胞中获得成功，最后到iPS细胞应用于疾病模型动物的治疗，整个过程只用了短短一年半的的时间。今后，iPS细胞的研究会成为生命科学领域的一个重要方向，随着技术的不断进步，相信iPS研究的进展会比人们想象中更为迅速。现在，我们从iPS细胞上看到了它为人类疾病治疗所带来的希望和契机，我们期望，iPS细胞所面对的的问题会在不就得将来得到解决，最终有望真正用于造福人类健康。

患者 女，66岁。因“活动后胸闷气短5年，加重1个月”入院。患者于9年前行肾移植手术。查体：体温36.6℃，脉搏90次/分，呼吸20次/分，血压105/60mmHg。心界向左下方增大，心尖部可见抬举样搏动。胸骨右缘第二肋间闻及3/6级舒张中晚期叹息样杂音，周围血管征（+）。化验检查示：尿素7.8mmol/L，尿酸157.0umol/L，肌酐57.7umol/L。心电图示：窦性心律，心电轴左偏，左心室肥大、劳损。胸片示:两肺纹理清晰，左室增大，心影呈主动脉型，升主动脉梭形增宽，肺动脉段不凸，心胸比率0.56。超声心动图显示(图 A和B)：左室增大，主动脉瓣四叶四窦，呈前后左右排列，收缩期主动脉瓣开放呈口字形，舒张期关闭呈田字形，中央可见关闭裂隙，瓣叶局部轻度增厚钙化，右前与右后冠瓣交界轻度粘连， CDFI示舒张期主动脉瓣下见大量返流信号，缩流径7.7mm，沿二尖瓣前叶走行，导致二尖瓣前叶开放幅度轻度减低。CW示主动脉瓣前向血流速度增快，压差36mmHg，平均压差21mmHg。主动脉窦及升主动脉增宽，主动脉弓降部起始处内径增宽，内径31mm。术前临床诊断：主动脉瓣四叶畸形，主动脉瓣关闭不全（重度）并狭窄（轻度），二尖瓣关闭不全（轻度），三尖瓣关闭不全（轻度），左室增大，左室肥厚，心功能三级，肾移植术后。入院后给予强心、利尿、扩血管、营养心肌等常规治疗，完善各种检查。患者住院后继续服用肾移植术后长期服用的免疫抑制药物，具体为新赛斯平（环孢素胶囊）50mg,1日2次，晓悉（吗替麦考酚酯）0.25g,1日2次。完善各种检查，明确诊断和手术适应症，排除手术禁忌证后，在全麻气管插管低温体外循环下行主动脉瓣置换术。术中探查（图C）：左室肥大，主动脉根部扪及双期震颤，升主动脉增宽，主动脉瓣四叶四窦，呈前后左右排列，瓣叶局部轻度增厚钙化，右前与右后冠瓣交界轻度粘连，四叶对合不拢，关闭不全。置换进口圣犹达25号生物瓣一枚，手术顺利。术前当天新赛斯平（环孢素胶囊）50mg和晓悉（吗替麦考酚酯）0.25g口服。术中静脉给予甲强龙500mg，术后当天静脉给予加强龙150mg，连续3天。术后第1天，继续开始服用新赛斯平（环孢素胶囊）50mg,1日2次，晓悉（吗替麦考酚酯）0.25g,1日2次。术后第1天拔除气管插管，引流不多，第3天拔除引流管。术后给予常规抗生素预防感染，同时给予强心利尿扩血管及抗凝等治疗。术后每天监测肾功能，未发现明显的肾功能指标异常。病人恢复顺利，体温正常，循环稳定，未见明显排斥反应。术后13天，复查血常规及肾功能等均在正常范围内，复查超声心动图及心脏平片等未见异常，刀口Ⅰ/甲级愈合，痊愈出院。讨论 主动脉瓣四叶畸形是十分罕见的心脏瓣膜畸形。正常主动脉瓣由三个半月瓣组成，瓣膜的数量和结构完整是主动脉瓣正常关闭的解剖基础。主动脉瓣畸形发生率较低，通常有单叶瓣、二叶瓣、四叶瓣畸形。二叶瓣相对多见，单叶瓣、四叶瓣极少见。四叶瓣畸形可表现为对称型和不对称型。本例报道为不对称型，右前瓣和右后瓣相对较小，关闭时总体呈田字形，但是对合不拢，关闭明显不严，开放时呈口字形，轻度受限。先天性主动脉瓣四叶畸形很少合并其他先天性心脏畸形，但本身可以引起血流动力学异常，发生率为44%[1]，以主动脉瓣关闭不全最为常见，无血流动力学异常的主动脉瓣四叶畸形无临床症状，不需处理。如有重度瓣膜功能损害，则需施行主动脉瓣置换术或成形术。本例主动脉瓣四瓣畸形引起了严重的主动脉瓣关闭不全和轻度的狭窄，左室代偿性肥大，左室功能受损，患者临床症状明显，符合主动脉瓣置换术手术指征。但患者9年前行过肾移植手术，术后长期服用免疫抑制药物，这增加了手术的风险和难度，我们通过在术中静脉给予500mg的甲强龙以及术后连续三天静脉给予150mg甲强龙的方法，来抑制免疫排斥反应，同时发挥其在术中抗炎、抗过敏的作用。对于术中出现的主动脉管壁薄脆引起多处渗血的情况，分析推测其与患者长期服用免疫抑制药物相关，这种情况下涤纶片固定包绕主动脉壁的方法具有很好的大范围压迫止血效果，这在术中和术后都得到了证实。主动脉瓣四叶畸形所致瓣膜返流及狭窄合并肾移植术后的病人，有明确的手术适应症，给予瓣膜置换手术。只要术前和术后给予正确的免疫排斥药物及激素得到正确应用[2]，可以避免术中术后急性排斥反应的发生。主动脉瓣四叶畸形合并肾移植术后的病例未见报道，本病例对于肾移植术后病人的主动脉瓣置换术的实施以及围手术期免疫排斥问题的应对具有很高的参考意义。

患者 男，44岁。因“心慌憋气1年，加重1个月”入院。查体：体温36.6℃，脉搏90次/分，呼吸20次/分，血压125/60mmHg。双下肢有轻度水肿。心电图示：正常窦性心律。胸片示:心影饱满，右心缘局部向外膨隆，密度较心脏密度低。超声心动图显示：右房顶部可见团块样中高回声，薄膜清晰，内部回声均匀，大小约5cm×5cm，无活动，压迫右房。CT检查示：纵隔内肺动脉下方，左右心房间见低密度影，邻近左右心房受压变形，造影剂强化后肿瘤无明显增强，考虑脂肪瘤（图一）。其它常规检查未见异常。入院诊断：心脏占位，三尖瓣关闭不全。患者入院后完善各种检查，明确诊断和手术适应症，排除手术禁忌证后，于2013年9月行心脏肿瘤切除术。根据检查结果，预定手术方案是在非体外循环下行心脏肿瘤切除术。打开心包后，探查肿瘤大小和位置，发现肿瘤与心包无粘连，紧贴右心房上部、前部，向右侧延续覆盖房间沟、左房，一直向后延伸覆盖大部分右心室后壁，肿瘤上部延续包绕右肺静脉和上腔静脉(图二)。大小约：30cm×25cm×10cm。见于肿瘤位置复杂以及非体外循环下手术操作难度大，我们改用建立体外循环但心脏不停跳下行肿瘤切除术。切除肿瘤过程中，发现肿瘤与心脏及血管交界处界限均不清，没有完整包膜。肿瘤与心脏之间没有明显的蒂，但也未侵入心肌内。手术操作难度大，经过缓慢分离，最终将肿瘤几近完整从心脏上分离下来。整个手术过程心率均为正常窦性心率，循环稳定。术后病理检查：切除肿瘤约17cm×12cm×5cm，肉眼观切面质地均匀、黄色，镜下主要由成熟脂肪细胞组成。HE染色示脂肪组织，病理诊断为脂肪瘤。术后病人恢复良好，术后7天痊愈出院。术后7天复查超声心动示心功能良好，心脏未见异常组织。心电图为正常窦性心律。心脏平片示正常心影大小。讨论 原发性心脏肿瘤非常罕见，尸检表明其发生率约0.2%～0.4%[1]。大约80%的原发性心脏肿瘤良性，成人中粘液纤维瘤最常见，其次是脂肪瘤和纤维瘤，另外20%的心脏原发性肿瘤为恶性，最常见的为横纹肌肉瘤和血管肉瘤[2]。心脏脂肪瘤占心脏原发性肿瘤的8.4%，常见于成人但可以发生于各个年龄段[2,3]。25%心脏脂肪瘤发生于心肌内，25%发生于心腔外，来源于心外膜；50%发生于心腔内，来源于心内膜。[4] 。脂肪瘤大多数有蒂，有完整包膜。本例患者肿瘤位于心包腔内，来源于心外膜，紧贴心脏表面，没有蒂也没有完整包膜。心脏脂肪瘤通常不引起症状，偶在心脏超声、CT、MRI检查中偶然发现，CT和MRI能鉴别心脏脂肪瘤和其他肿瘤[5,6]。心脏脂肪瘤大多良性，而且通常生长缓慢，其影响取决于其位置和大小，但为防止其压迫心脏带来的症状，需要手术切除。本例患者术前有憋气症状，双下肢有水肿，表明肿瘤对心脏有压迫症状，需要行肿瘤手术切除。本例术前超声报告肿瘤位于右房顶部，肿瘤游离部分包膜清晰，但是术中打开心包发现，肿瘤除了一部分位于右房顶部之外，还向右侧延续覆盖房间沟、左房，一直向后延伸覆盖大部分右心室后壁，二肿瘤上部延续包绕右肺静脉和上腔静脉。因此，手术方案也由预定的非体外循环下肿瘤切除术，改为体外循环下心脏不停跳行肿瘤切除术。另外，肿瘤切除过程中，发现肿瘤与心脏及血管交界处界限均不清，没有完整包膜。肿瘤与心脏之间没有明显的蒂，但未侵入心肌内。肿瘤位置复杂，手术操作难度大。我们用头端带纱布包绕的血管钳，缓慢推分肿瘤与心脏交界，施行顿性分离；同时用剪刀剪开肿瘤与心脏的系膜连接处，间断锐性分离。经过缓慢分离，最终将肿瘤几近完整从心脏上分离下来。整个手术过程心率均为正常窦性心率，未出现心律失常。术后患者恢复顺利，效果良好，7天出院。另外，心脏脂肪瘤可复发，应密切随访。本例患者心脏脂肪瘤巨大，30cm×25cm×10cm，尚未见文献报道。